成果简介
N-乙酰神经氨酸，又称燕窝酸（NeuAc），是燕窝的主要功能成分。燕窝酸作为食品营养强化剂、化妆品功能因子和抗病毒药物合成前体，被广泛应用于食品、化妆品和医药领域。本项目使用的枯草芽孢杆菌为食品安全级菌株，生产菌株不含有质粒，并且发酵过程不需添加抗生素和诱导剂，可实现高效NeuAc生物制造。NeuAc产量在达到58.0 g/L，显著高于行业平均水平，并且产物在合成和常温储存过程中稳定性高，有利于产物高效分离纯化。
图1 NeuAc功能和合成途径
关键技术
为了在食品级安全菌株枯草芽孢杆菌中实现利用廉价底物高效从头合成NeuAc，本项目开展了以下5方面工作：
(1) 通过引入氨基葡萄糖6-磷酸乙酰基转移酶、N-乙酰氨基葡萄糖2-异构酶和N-乙酰神经氨酸合酶，构建了NeuAc合成途径；
(2) 通过筛选高性能途径酶、关键酶定向进化工程和表达水平优化工程，构建NeuAc多通道合成系统；
(3) 基于葡萄糖和甘油的双碳源共利用系统模块化优化组装，实现了NeuAc前体供给的平衡；
(4) 通过构建基于葡萄糖酸或NeuAc响应元件激活的CRISPRi分支途径下调系统，实现了NeuAc合成过程的动态优化；
(5) 通过设计和优化基于spo0A系统调控的无芽孢底盘细胞工程，开发细胞碳源饥饿发酵工艺，在5 L发酵罐水平NeuAc产量达到58.0 g/L。
图2 枯草芽孢杆菌合成NeuAc项目技术指标
知识产权
相关技术获授权发明专利10项，代表性专利如下：
(1) 一种积累N-乙酰神经氨酸重组枯草芽孢杆菌及其应用，ZL201710278055.2
(2) 一种提高N-乙酰神经氨酸产量的重组枯草芽孢杆菌，ZL201710277428.4
(3) 一种利用人工双碳源高产N-乙酰神经氨酸的重组菌，ZL201810239293.7
(4) 一种利用天然双碳源高产N-乙酰神经氨酸的重组菌，ZL201810239281.4
(5) 一种枯草芽孢杆菌中唾液酸诱导表达元件及构建方法，ZL201910358649.3。
图3 5 L发酵罐NeuAc发酵曲线
项目成熟度
已完成实验室小试。产量在达到58.0 g/L，显著高于行业平均水平，并且产物在合成和常温储存过程中稳定性高，有利于产物高效分离纯化。具备较大市场转化前景，具有完全自主知识产权。
成果完成人：陈坚
联系人：刘延峰 电话：15261501025
江南大学产学研
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